Разработка модифицированной версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М» – Статьи за 2005-2006 гг. – Публикации – Федеральный Центр СПИД

0

Богословская Е. В., Башкирова Л. Ю., Шипулин Г. А. // Разработка модифицированной версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М». // Сборник тезисов 5-й Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных болезней. — Москва, 2004. С. 173-180.

Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва

Введение

На сегодняшний день из 42 миллионов человек, живущих с ВИЧ-инфекцией, 3,2 миллиона составляют дети. По оценкам Программы ООН по ВИЧ/СПИД (UNAIDS) в 2003 году 700.000 детей были инфицированы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), из них 90% — дети, рожденные инфицированными матерями, и получившими вирус внутриутробно, в родах или при грудном вскармливании. В России по состоянию на 10 февраля 2004 года зарегистрировано 266820 случаев ВИЧ-инфекции, из них 9154 среди детей. В 2002 году от ВИЧ-инфицированных матерей родилось 2770 детей — это 60% от всех рожденных в России детей с риском перинатальной передачи ВИЧ.

Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, затруднена в связи с тем, что в крови таких детей в течение длительного времени сохраняются материнские антитела к ВИЧ. Но далеко не каждый ребенок, рожденный инфицированной женщиной, заражен ВИЧ. Риск вертикальной передачи ВИЧ-инфекции колеблется от 10 до 40%. Проведение профилактических мероприятий (противовирусная терапия, родоразрешение путем кесарева сечения, отказ от кормления грудью и другие мероприятия) позволяют снизить риск передачи ВИЧ до 2-5%. По существующим в России рекомендациям постановка или снятие диагноза ВИЧ-инфекции детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, проводится на основании результатов серологического обследования не ранее 18 месяцев [1].

Проблема более ранней диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей за рубежом была решена несколько лет назад с появлением молекулярно-генетические методов, которые позволяют выявлять фрагменты генома ВИЧ в периферической крови на ранних сроках инфицирования. Было показано, что у большинства инфицированных детей ДНК ВИЧ определяется к 1 месяцу жизни и практически у всех к 6 месяцу. В России до сих пор молекулярные методы диагностики ВИЧ у новорожденных детей не нашли широко применения. В основном это связано с высокой стоимостью зарубежных тест-систем и отсутствием до последнего времени аналогичного теста отечественного производства.

В 1997 году в Центральном НИИ Эпидемиологии МЗ РФ была разработана тест-система (на основе полимеразной цепной реакции) для выявления ДНК ВИЧ «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96». Тест-система прошла Государственные испытания в ГИСК им. А. Л. Тарасевича, и в 2002 году было получено разрешение Министерства Здравоохранения на применение тест-системы на территории РФ (регистрационное удостоверение №PN001634/01-2002; лицензия на производство №15/0002-Л/02). Единственной зарубежной тест-системой, доступной в России, является „Amplicor HIV 1 test” фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария). Методики, положенные в основу отечественной и зарубежной тест-систем, аналогичны. В обеих тест-системах используются одинаковые праймеры, комплиментарные области генома ВИЧ — gag — гену, предложенные в 1988 году Shirley Kwok. Клинические испытания отечественной тест-системы были проведены на 175 образцах от 107 пациентов в сравнении с тест-системой „Amplicor HIV 1 test”. Были определены основные характеристики тест-системы: чувствительность 96%, специфичность 100% [3].

В последние годы стали появляться данные о том, что тест-система „Amplicor HIV 1 test” обладает более низкой чувствительностью по сравнению с заявленной. Было показано, что используемые в тест-системе праймеры позволяют детектировать 87% изолятов подвида А, 67% изолятов подвида В, 66% изолятов подвида Е, 88% изолятов подвида F [2]. Поэтому чувствительность тест-системы зависит от распространенности разных подвидов ВИЧ на данной территории. На территории России распространено большинство из известных подвидов ВИЧ. Кроме того, если до 1996 года в России доминировал субтип В, то в 2002 году субтип А составил 93% от всех субтипов (по данным Бобкова А. Ф.).

Другим важным недостатком тест-систем как „Amplicor HIV 1 test”, так и «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» является нестандартизованный метод выделения ДНК из клеток крови и отсутствие внутреннего контроля, что создает зависимость от качества выполнения процедур в процессе выделения ДНК и увеличивает частоту артефактных ложноотрицательных результатов. В 2003 году сотрудниками ФНМЦ СПИД была проведена оценка клинической чувствительности и специфичности тест-системы „Amplicor HIV 1 test” по результатам работы региональных центров СПИД [4]. Показатель специфичности составил 99%, показатель чувствительности 51%. Низкая выявляемость ВИЧ могла быть обусловлена двумя причинами: недостаточной чувствительностью праймеров в отношении доминирующего в России субтипа А, а также плохим уровнем подготовки персонала, что в совокупности с отсутствием внутреннего контроля в тест-системе приводило к получению ложноотрицательных результатов. В связи с этим целью настоящей работы была разработка и апробация второй версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М».

Материалы и методы. В работе были исследованы образцы цельной крови, полученные от следующих пациентов.

Первая группа была представлена 465 образцами цельной крови от 230 детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей и наблюдающихся стационарно или амбулаторно в КИБ №2 г. Москвы за период 1998-2001 гг. Возраст детей колебался от 1 дня до 1,5 лет.

Вторая группа состояла из 205 образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов, полученных из 12 регионов Российской Федерации в 2003 году. Все образцы были типированы методом секвенирования четырех фрагментов генома ВИЧ: гена протеазы, фрагмента гена обратной транскриптазы, фрагмента гена gag и фрагмента гена поверхностного белка. Из 205 образцов 93% составил субтип А, 5% — субтип В, 1,5% — субтип G, 0,5% — субтип С.

Подготовка проб крови. Кровь забирали из локтевой вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА. Цельную кровь хранили при температуре +2-80°С не более 3 дней.

Выделение ДНК из клеток крови. Выделение ДНК проводили с помощью двух методик. Первый вариант представляет собой грубый лизис эритроцитов крови с помощью раствора «Гемолитик» (производства ЦНИИЭ МЗ РФ), в результате чего получали осадок лейкоцитов. Второй вариант представляет собой селективную иммуно-сорбцию CD4-лимфоцитов с помощью магнитных частиц, покрытых антителами к CD4 рецепторам, и полуавтоматического экстрактора KingFisher («Thermo Labsystems», Финляндия). В результате получали осадок CD4-лимфоцитов. Затем осадки лейкоцитов или CD4-лимфоцитов лизировали с помощью раствора «Цитолизин» (производства ЦНИИЭ МЗ РФ) при температуре 60°С в течение 30 минут.

Амплификация. Для эффективного выявления большинства субтипов ВИЧ-1 нами были выбраны праймеры в наиболее консервативной области генома ВИЧ — гене полимеразы. При подборе праймеров использовали базы данных нуклеотидных последовательностей и программы BLAST и OLIGO 3.30. Праймеры синтезировали с помощью автоматического синтезатора ASM102. На 5`-конце один из праймеров мечен биотином, который необходим для гибридизационно-ферментной детекции продуктов амплификации.

Для оценки эффективности выделения ДНК, а также возможного ингибирования ПЦР были разработаны праймеры для амплификации участка клеточной ДНК — гена b-глобина. Один из праймеров для амплификации гена b-глобина на 5`-конце был помечен биотином.

Реакционная смесь для ПЦР содержала две пары праймеров: для выявления ВИЧ и гена b-глобина. Амплификацию проводили по программе: 950С — 5 минут, 5 циклов: 950С — 15 секунд, 550С — 15 секунд, 720С — 15 секунд, 30 циклов: 950С — 15 секунд, 580С — 15 секунд, 720С — 15 секунд.

Гибридизационно-ферментная детекция продуктов ПЦР. Детекцию осуществляли методом гибридизационно-ферментного анализа на иммунологических планшетах, покрытых одноцепочечным ДНК зондом, комплиментарным внутренней части ампликона. Для детекции продуктов ПЦР использовали два микропланшета: один — покрытый зондом к ВИЧ, второй — покрытый зондом к гену глобина.

Пробу считали положительной, если оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к ВИЧ, превышала 0,35 ОЕ. Пробу считали отрицательной, если оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к ВИЧ, была меньше 0,35 ОЕ, а оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к гену глобина, превышала 0,35 ОЕ.

Выявление ДНК ВИЧ с помощью тест-системы „Amplicor HIV 1 test”. 205 образцов цельной крови от детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, было протестировано параллельно с помощью двух тест-систем „Amplicor HIV 1 test” и «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М». Определение ДНК ВИЧ с помощью тест-системы „Amplicor HIV 1 test” осуществляли согласно прилагаемой инструкции.

Тестирование коммерческой панели субтипов. Для того, чтобы доказать, что выбранные нами праймеры в области гена полимеразы эффективно выявляют большинство субтипов ВИЧ-1, была протестирована панель образцов плазмы крови (содержащая 10 субтипов ВИЧ-1), предоставленная Национальным институтом биологических стандартов и контролей Великобритании (NIBSC) (кат. №01/466). Образцы плазмы тестировали с помощью количественной тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» (ЦНИИЭ МЗ РФ), в которой используются те же самые праймеры, комплиментарные гену полимеразы. Для сравнения результатов были использованы коммерческие тест-системы „Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5” фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария) и „LCx HIV RNA Quantitative assay” фирмы «Эбботт» (США). В тест-системе „Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5” используются праймеры, отличные от тех, которые используются в качественной тест-системе „Amplicor HIV-1 test”.

Результаты

Коммерческая панель образцов NIBSC, содержащих вирусные препараты 10 субтипов ВИЧ-1, была проанализирована с помощью трех количественных тест-систем „Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5” («Хоффманн-Ла Рош», Швейцария), „LCx HIV RNA Quantitative assay” («Эбботт», США) и «АмплиСенс ВИЧ Монитор» (ЦНИИЭ МЗ РФ). Результаты измерения концентрации РНК ВИЧ представлены в таблице 1.

Субтипы ВИЧ-1 Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5 LCx HIV RNA Quantitative assay АмплиСенс ВИЧ Монитор
1 C 3,68×103 3,54х103 1,62х104
2 H 1,25×104 5,40х103 1,58х104
3 A 4,31×103 3,80х103 1,17х104
4 N 2,63×103 596