Федеральный Центр СПИД

0

Шахгильдян В.И., Шипулина О.Ю., Сильц В.В., Шамшурина М.К., Серебровская Л.В., Каражас Н.В., Евсеева Л.Ф., Звонарев А.Ю., Баранова Е.Б., Калинина Н.А., Коростылев А.В.

ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МАРКЕРОВ АКТИВНОЙ РЕПЛИКАЦИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН ПРИ ОЦЕНКЕ РИСКА ВРОЖДЕННОЙ И ВНУТРИУТРОБНОЙ ЦМВ-ИНФЕКЦИИ

Федеральный научно-методический центр профилактики и борьбы со СПИДом МЗРФМосковский городской центр СПИДа Департамента здравоохранения г. Москвы Инфекционная клиническая больница №2 г. МосквыНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.  Гамалеи РАМН

ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Москва

Внутриутробное инфицирование плода — важная проблема современного акушерства. В структуре перинатальной смертности внутриутробная инфекция составляет от 2 до 65.6%  случаев [7]. Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является наиболее частой врожденной вирусной патологией и служит основной причиной врожденных пороков, задержки психического и умственного развития у детей раннего возраста, не имеющих хромосомных нарушений [17]. ЦМВИ — главная причина врожденной сенсорноневральной потери слуха [17, 22]. В США ежегодно регистрируются не менее 7000 пациентов с неврологическими нарушениями цитомегаловирусной этиологии [13]. В различных странах мира частота внутриутробного заражения плода цитомегаловирусом (ЦМВ) колеблется от 0.3%  до 3% [6, 11, 17, 21]. В России данный показатель составляет 1% — 2.8%  [3, 4, 5, 10]. Заражение цитомегаловирусом плода может привести к его гибели, самопроизвольным выкидышам, порокам развития, мертворождению [6, 9, 12] . При развитии у матери во время беременности острой ЦМВИ, инфицированные младенцы в 10% — 15% случаях имеют клинически выраженную патологию [18, 22]. Более чем в половине случаев отмечается гепатоспленомегалия, желтуха и петехии в сочетании с повышением активности АЛТ, концентрации прямого билирубина, тромбоцитопенией [5, 22]. Характерны гипотрофия, недоношенность, не редки тяжелые поражения головного мозга (микроцефалия, гидроцефалия, судорожный синдром, заторможенность, слабый сосательный рефлекс), а также генерализованное поражение органов с развитием шока, ДВС-синдрома с риском летального исхода до 11 — 20% впервые 6 недель жизни ребенка [3, 6, 9, 10, 22]. У большинства выживших детей с клиническими проявлениями ЦМВИ и у 5 — 15% инфицированных детей, не имеющих при рождении признаков заболевания, развиваются поздние осложнения врожденной цитомегалии, проявляющиеся в виде задержки физического и умственного развития, судорожных расстройств, сенсорноневральной глухоты, хориоретинита с возможной атрофией зрительного нерва [3, 10, 20, 22].

Проблема внутриутробной патологии у ВИЧ-инфицированных беременных женщин становится все более актуальной. В России показатель выявляемости ВИЧ-инфекции среди беременных женщин увеличился в 2002 г., по сравнению с 1998 г., в 22 раза, а по сравнению с 1995 г. — в 573 раза [1, 2]. Распространенность ВИЧ-инфекции среди беременных женщин в настоящее время составляет 0.1%  [8].

Ежегодно в нашей стране увеличивается число детей, рожденных ВИЧ-инфици-рованными матерями. Если в общей структуре факторов риска ВИЧ-инфекции в 1999 г. доля детей с риском перинатального заражения составляла 1.7%, то в 2003 г. — 16.4%  [1, 2, 8]. Половина (55.3%) от общего количества российских детей, матери которых страдали ВИЧ-инфекцией, появилась на свет в 2002 году [8]. Благодаря широкому применению схем лекарственной профилактики вертикальной передачи ВИЧ частота передачи вируса от матери к ребенку снизилась с 30 — 40% до 1 — 2% [2]. В то же время сохраняет свою остроту вопрос об иных внутриутробных инфекциях, которые могут поражать плод и новорожденного у ВИЧ-инфицированной матери. Согласно результатам зарубежных исследований [15, 16], частота трансплацентарного заражения ЦМВ существенно выше у младенцев, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, по сравнению с новорожденными, матери которых были ВИЧ-серонегативны. Возможно, ЦМВ является фактором, влияющим на передачу ВИЧ от матери к ребенку [14, 19]. При этом у детей, инфицированных как ВИЧ, так и ЦМВ, отмечалась более глубокая иммуносупрессия и более быстрое прогрессирование ВИЧ-инфекции [18]. В 2002 г. в Москве умерли 7 детей, инфицированных ВИЧ, из них три ребенка страдали ЦМВИ.

Согласно выше изложенному, ребенок, рожденный ВИЧ-инфицированной матерью, должен быть защищен не только от внутриутробной передачи ВИЧ, но и от иных врожденных инфекций (в частности ЦМВИ), которые могут служить причиной его болезни и гибели. В то же время вопрос о достоверных лабораторных критериях высокого риска заражения цитомегаловирусом ребенка в период его внутриутробного развития остается открытым. Цель нашей работы состояла в определении значения различных специфических лабораторных признаков активной репликации цитомегаловируса у беременных ВИЧ-инфицированных женщин в качестве прогностических маркеров врожденной и внутриутробной ЦМВ-инфекции.

Материалы и методы.

С 2000 по 2002 гг. под наблюдением находились 130 беременных ВИЧ-инфици-рованных женщин и 128 рожденных ими детей. Женщины наблюдались в МГЦ СПИД (руководитель центра Мазус А.И.), родовспоможение осуществляли в родильном доме ИКБ №2 (главный врач роддома Крахмалова Т.А., главный врач больницы Мясников В.А.). Возраст женщин был от 16 до 32 лет; средний возраст составил 21.9+  2.3 года. Половина пациенток инфицировалась ВИЧ половым путем, 47% — при использовании внутривенных наркотических препаратов. Диагноз ВИЧ-инфекции был подтвержден обнаружением в сыворотке крови специфических антител к ВИЧ методами ИФА и иммунного блотинга. В соответствии с клинической классификацией В.И.  Покровского, у 127 женщин была диагностирована ВИЧ-инфекция в стадии первичных проявлений (IIБ-В), 3 человек имели стадию вторичных заболеваний IIIА. Ни в одном случае не был поставлен диагноз СПИДа. Химиопрофилактика вертикальной передачи ВИЧ проводилась всем женщинам и новорожденным, согласно протоколу PACTG 076, с применением тимазида и ретровира.

У большинства женщин беременность протекала без существенных патологических отклонений. В 2 случаях имел место спонтанный аборт и внутриутробная гибель плода. Роды у женщин проходили естественным путем, лишь в 3 случаях было осуществлено кесарево сечение. Среди наблюдавшихся 128 новорожденных 18 (14.1%) родились недоношенными, в большинстве случаев с признаки внутриутробной гипотрофии. Все дети находились на искусственном вскармливании.

Каждое обследование беременной женщины и ее новорожденного ребенка включало исследование крови на наличие антител к ЦМВ классов IgМ и IgG (с определением титров и индекса авидности), анти-ЦМВ IgG к ранним вирусным белкам, определение цитомегаловируса в моче, ДНК ЦМВ в слюне, моче и крови. У 30 женщин был исследован на наличие ДНК ЦМВ материал, полученный при соскобе из цервикального канала. Большинство женщин (86) прошли обследование однократно, 33 человека — двукратно, 11 — трехкратно (в каждом триместре беременности). Новорожденные были обследованы в возрасте одной недели и одного месяца.

Серологические исследования осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих диагностических наборов («DSL» USA, «ВекторЦМВ-IgG-стрип» ЗАО «Вектор-Бест», «ЦМВ-Диагност» ЗАО «Биосервис», «ЦМВ-Контроль» ПКБ им. И.И.  Мечникова« РФ) согласно инструкциям, прилагаемым к ним.

Обнаружение цитомегаловируса в моче пациентов проводили путем изоляции ЦМВ на зараженной чувствительной клеточной культуре. Идентификация вируса была основана на характерном цитопатическом эффекте и на определении ЦМВ-антигенов методом НРИФ (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.  Гамалеи).

Качественное определение ДНК ЦМВ в цельной крови выполняли с помощью ПЦР-тест-системы «АмплиСенс Цитомегаловирус-500/ВКО» ЦНИИЭ МЗ РФ. Аналитическая чувствительность «АмплиСенс ПЦР-тест-системы» составляла 500 копий ДНК ЦМВ в 1 мл цельной крови. Наличие ДНК ЦМВ в слюне, моче, соскобах из цервикального канала определяли методом ПЦР с помощью тест-систем производства ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ.

Среди показателей системы иммунитета определяли количество CD4+ и CD8+ — лимфоцитов с использованием моноклональных антител фирмы «Becton Diskinsan, USA» методом проточной цитофлюорометрии.

Используемые термины. Врожденная ЦМВИ — инфицирование плода в антенатальном периоде развития [5, 10, 12]. Подтверждением диагноза служило выявление ДНК ЦМВ в крови или моче ребенка в первые 7 дней его жизни. Внутриутробная ЦМВИ — инфицирование плода в позднем антенатальном или интранатальном периодах [5, 10, 12]. Диагноз ставился при первом обнаружении ДНК ЦМВ в крови или моче ребенка в возрасте одного месяца.

Положительное и отрицательное прогностические значения лабораторного маркера активности ЦМВ как фактора риска врожденной ЦМВИ определяли следующим образом. Согласно полученным данным, обследуемые женщины были распределены в одну из четырех возможных групп, в зависимости от отрицательного или положительного значения лабораторного признака, а также наличия или отсутствия врожденной ЦМВИ у родившегося ребенка. Соответственно, по каждому лабораторному параметру были составлены следующие группы:

— с «истинно-положительным» (ИП) в отношении диагноза ЦМВ-инфекции значением маркера, когда присутствовал и лабораторный маркер у беременной женщины, и врожденная ЦМВИ у ребенка;

— с «ложноположительным» значением (ЛП), когда имелся лабораторный маркер, но отсутствовала врожденная ЦМВИ;

— с «истинно-отрицательным» значением (ИО), когда отсутствовали и лабораторный маркер, и врожденная ЦМВИ;

— с «ложноотрицательным» значением (ЛО), когда не было выявлено лабораторного маркера, но имелась врожденная ЦМВИ.

Положительное прогностическое значение лабораторного признака определяли согласно формуле 100% х ИП/(ИП+ЛО); отрицательное прогностическое значение — по формуле 100% х ИО/(ИО +ЛП). Аналогично рассчитывались прогностические значения лабораторных признаков для внутриутробной ЦМВИ.

Результаты и обсуждение.

Подавляющее большинство (96.9%) обследованных женщин имело в крови анти-ЦМВ IgG. Лишь 4 человека (3.1%) были серонегативны. Титры антител класса IgG у 96% лиц были низкими (менее 1:1000), 4 человека имели высокие титры (от 1:1500 до 1:3000), в 1 случае зафиксирован показатель 1:10000. Лишь у одной женщины за время беременности отмечено повышение титров антител более чем в 4 раза. В 94.6%  случаев были выявлены высокоавидные противоцитомегаловирусные иммуноглобулины класса G. Только у 7 человек (5.4%) анти-ЦМВ IgG имели низкую степень активности, что могло свидетельствовать о сравнительно недавнем инфицировании вирусом. Ранние антитела класса IgG к ЦМВ выявили у 16 (12.3%) пациенток.

Специфические антитела класса IgМ были обнаружены только в 2 случаях (1.5%), причем у обеих женщин определяли и иммуноглобулины класса G, что предполагало не первичное заражение ЦМВ, а его реактивацию или реинфекцию.

Цитомегаловирус присутствовал в моче у 19 (14.6%) беременных женщин.

ДНК ЦМВ была выявлена в слюне у 32 (24.6%) женщин, в моче — у 24 (18.5%), в крови — у 12 (9.2%). Реактивизация ЦМВ, как и повторное инфицирование вирусом могут иметь место на любых сроках беременности. В связи с этим, вероятность выявления ДНК ЦМВ в биологических жидкостях (прежде всего, в моче и крови) зависела от кратности обследования и была выше при повторении исследования в следующем триместре беременности. Так, при первичном анализе наличие ДНК ЦМВ в слюне было установлено у 30 женщин, при повторном исследовании — дополнительно лишь у двух пациенток. Напротив, при очередном обследовании 44 пациенток ДНК ЦМВ в моче и крови была выявлена, соответственно, еще у 10 и 3, помимо четырнадцати и девяти, имевших положительный результат при начальном скрининге.

Согласно результатам проведенных 190 комплексных исследований слюны, мочи и крови на наличие в них ДНК ЦМВ, в подавляющем большинстве случаев ДНК ЦМВ не была обнаружена ни в одной биологической жидкости (132) или присутствовала лишь в слюне (26). В 16 исследованиях ДНК ЦМВ была выявлена только в моче, в 5 — только в крови, в 11 случаях — в обеих биологических жидкостях.

Корреляции между наличием в крови иммуноглобулинов класса M, низкоавидных специфических IgG антител, высоких титров анти-ЦМВ IgG, ранних IgG к ЦМВ, присутствием цитомегаловируса в моче в нашем исследовании не установлено. Не выявлено и корреляции между серологическими маркерами и наличием ДНК ЦМВ в слюне, моче или крови беременных женщин.

В материалах соскобов из цервикального канала ДНК ЦМВ выявили у 10 из 30 обследованных женщин (33.3%  случаев). Высокая частота обнаружения ЦМВ в биопсийном материале у ВИЧ-инфицированных беременных женщин свидетельствует о значительном риске заражения их детей цитомегаловирусом во время родов.

Результаты параллельных 30 исследований на присутствие ДНК вируса в моче и соскобах из цервикального канала совпали лишь у половины пациентов: 5 случаев — идентичный положительный ответ, 11 — отрицательный. У 5 женщин ДНК ЦМВ была выявлена только в моче, у 9 — только в биопсийном материале.

Анализ иммунограмм инфицированных ВИЧ беременных женщин не выявил выраженных изменений показателей клеточного звена иммунной системы. Снижение числа Т-хелперов/индукторов (СD4+-лимфоцитов) не было значительным и, в среднем, составило 790 + 350 кл/мм3 (при норме 600 — 1900 кл/мм3). Уменьшение количества CD4 клеток менее 350 в мм3 зафиксировано лишь у 5.5%  женщин. Глубокой иммуносупрессии с уровнем CD4-лимфоцитов менее 200 кл/мм3 не зафиксировано ни в одном случае. Средняя величина относительного количества CD4-клеток составила 32.5 + 4.2%  (при норме 35 — 65%). Содержание Т-супрессоров (СD8+-лимфоцитов) было умеренно повышенно как в абсолютном (950 + 70 кл/мм3, при норме 300 — 800 кл/мм3), так и в процентном (38.5 + 6.3%, при норме 12 — 30%) отношениях. Соотношение СD4/CD8 составило 0.95 + 0.14 (норма — более 1). Нами не отмечена корреляция между степенью выраженности изменений в иммунной системе и наличием активной ЦМВИ (присутствием ДНК ЦМВ в крови). Отсутствие выраженных иммунологических нарушений у наблюдаемых женщин, позволяет в определенной степени экстраполировать изложенные ниже результаты работы на контингент женщин, не инфицированных ВИЧ.

Факт трансплацентарного инфицирования ЦМВ плода был доказан в 11 случаях: самопроизвольное прерывание беременности на ранних сроках (1), гибель плода (1) (с обнаружением ДНК ЦМВ в аутопсийных материалах), выявление ДНК ЦМВ в крови или моче на 1-й неделе жизни ребенка (9 детей). Соответственно, врожденная ЦМВИ диагностирована в 8.5%  случаев. Антенатальное инфицирование плода установлено у 21.9%  женщин, имевших ДНК ЦМВ в слюне, 29.2%  женщин с ДНК ЦМВ в моче и 58.3%  женщин с наличием ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови. Отметим, что заражения плода не было ни у одной женщины с наличием ДНК ЦМВ лишь в слюне, но имело место в случаях содержания ДНК ЦМВ только в моче или только в крови.

Среди 9 новорожденных, инфицированных ЦМВ в период внутриутробного развития, один ребенок был недоношенным, родившимся на сроке 29 недели беременности, трое имели признаки гипотрофии 1 — 2 степени. В 8 случаях диагностирована внутриутробная гипоксия, чаще проявляющаяся синдромом возбуждения, в 2 случаях имел место синдром дыхательных расстройств, у 2 детей — общий отечный синдром. Состояние трех младенцев расценивалось по шкале Апгар менее 6 баллов. В первые сутки после рождения 4 ребенка имели тяжелое состояние, четверо — средней тяжести.

Положительное и отрицательное значения лабораторных признаков активной репликации ЦМВ как факторов риска врожденной ЦМВИ показаны в таблице 1. Как следует из представленных данных, отрицательное прогностическое значение различных лабораторных маркеров ЦМВИ было высоким. Так риск трансплацентарного заражения плода ЦМВ составил менее 4%, если мать не имела в крови или моче ДНК вируса. Вместе с тем, положительное прогностическое значение таких широко используемых в практическом здравоохранении лабораторных критериев, как низкоавидные противоцитомегаловирусные иммуноглобулины класса G, высокие титры анти-ЦМВ IgG , присутствие ЦМВ в слюне или моче для определения риска заражения плода цитомегаловирусом, оказалось низким. Умеренную прогностическую ценность несет обнаружение специфических антител класса IgМ. Наиболее высокое положительное прогностическое значение имело наличие ДНК ЦМВ в крови. Почти 60% женщин с наличием в крови ДНК ЦМВ родили инфицированных цитомегаловирусом детей.

У 7 младенцев с отрицательными результатами анализов на первой неделе жизни ДНК ЦМВ была выявлена в крови и/или моче в возрасте одного месяца. Учитывая, что дети находились на искусственном вскармливании и им не проводили трансфузии крови и ее препаратов, наиболее вероятно их инфицирование в интранатальном периоде, а не на раннем неонатальном (первые 7 суток жизни) периоде. Следовательно, из 18 случаев внутриутробной ЦМВ-инфекции антенатальное заражение имело место в 11 (61%), интранатальное — в 7 (39%). Частота внутриутробной ЦМВИ составила 13.8%. Внутриутробная ЦМВИ диагностирована у детей одиннадцати из 32 женщин с наличием ДНК ЦМВ в слюне (34.4%), десяти из 24 женщин с ДНК ЦМВ в моче (41.7%) и десяти из 12 женщин с наличием ДНК ЦМВ в цельной крови (83.3%).

Положительное и отрицательное значения лабораторных маркеров активной репликации вируса как факторов риска внутриутробной ЦМВИ показаны в таблице 2. Как и в случае врожденной ЦМВИ, при внутриутробной инфекции отрицательное прогностическое значение различных специфических лабораторных маркеров как факторов риска заражения ЦМВ ребенка в период внутриутробного развития или во время родов достаточно высокое, а положительное прогностическое значение таких лабораторных показателей, как наличие антител класса IgМ к ЦМВ, низкоавидных противоцитомегаловирусных иммуноглобулинов класса G, ранних анти-ЦМВ IgG, повышение титров IgG, присутствие цитомегаловируса или ДНК ЦМВ в слюне или моче, — низкое.

Высокое положительное (83.3%) и наиболее высокое отрицательное (93.2%) значение для определения риска внутриутробной ЦМВИ имело определение ДНК ЦМВ в крови ВИЧ-инфицированной беременной женщины. Данные результаты свидетельствуют о серьезном риске заражения цитомегаловирусом ребенка в случае обнаружения ДНК ЦМВ в крови у матери. Указанный факт подтверждается и рядом последних зарубежных публикаций [17, 21]. Необходимо отметить, что исследование на наличие ДНК ЦМВ в крови особенно важно для ВИЧ-инфицированных беременных женщин, у которых не рекомендовано проведение амниоцентеза и кордоцентеза по причине высокого риска инфицирования плода вирусом иммунодефицита человека.

Для повышения значимости обнаружения ДНК ЦМВ в крови как фактора риска заражения ЦМВ плода и новорожденного необходимо проводить количественную оценку содержания ДНК вируса в крови беременной женщины. Определение концентрации ДНК ЦМВ в биологических материалах (прежде всего в крови), возможно, является ключом к разрешению многих вопросов, касающихся врожденной ЦМВИ не только у ВИЧ-инфицированных, но и ВИЧ-серонегативных беременных женщин.

Наличие ДНК ЦМВ в крови беременной женщины является признаком высокой активности инфекционного процесса. По-видимому, именно тем беременным женщинам, у которых обнаруживается вирус в крови, необходимо проводить иммунопрофилактическую терапию иммуноглобулином с высоким содержанием противоцитомегаловирусных антител (так называемым «гипериммуноглобулином») для предотвращения трансплацентарной передачи цитомегаловируса или для смягчения последствий, если заражение вирусом плода уже произошло.

1. Абсолютное большинство (96.9%) ВИЧ-инфицированных беременных женщин имеет антитела класса IgG к цитомегаловирусу.

2. Для беременных ВИЧ-инфицированных женщин характерна высокая частота выявления лабораторных признаков активной репликации цитомегаловируса (присутствие ДНК ЦМВ в крови — в 9.2%  случаев). Значительна частота обнаружения ДНК ЦМВ в материалах соскобов из цервикального канала — 33.3%  случаев.

3. Врожденная цитомегаловирусная инфекция у детей ВИЧ-инфицированных матерей имеет место значительно чаще (8.5%  случаев), по сравнению с младенцами, матери которых не страдают ВИЧ-инфекцией. Внутриутробная ЦМВ-инфекция была диагностирована у 13.8%  детей.

4. Выявление методом ПЦР ДНК ЦМВ в крови ВИЧ-инфицированной беременной женщины является достоверным признаком активной репликации ЦМВ и служит маркером высокого риска антенатального и интранатального заражения данным вирусом ребенка. Исследование крови и мочи женщин на наличие ДНК ЦМВ следует проводить в каждом триместре беременности.