Федеральный Центр СПИД

0

Башкирова Л.Ю., Богословская Е.В., Шипулин Г.А.

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии МЗ РФ, Москва

Введение.

Для диагностики ВИЧ-инфекции используется иммуноферментный анализ (обнаружение в крови антител к ВИЧ) с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга. Однако, метод ИФА не эффективен для диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Это связано с тем, что в крови у таких детей материнские антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение длительного времени, даже если ребенок не инфицирован ВИЧ. На сегодняшний день наиболее эффективным методом для ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет выявлять нуклеиновые кислоты вируса с высокой чувствительностью и специфичностью.

Для ПЦР-диагностики ВИЧ-инфекции в России используется две тест-системы: «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96», разработанная в Центральном НИИ Эпидемиологии МЗ РФ и «Amplicor HIV 1 test» фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария). Методики, положенные в основу этих тест-систем, аналогичны: тест-системы позволяют обнаружить ДНК провируса ВИЧ, интегрированного в геном мононуклеарных клеток периферической крови.

Одним из недостатков этих тест-систем является нестандартизованный метод выделения ДНК из клеток крови, требующий определенных навыков работы. При недостаточном уровне подготовки персонала данный метод может привести к значительному снижению чувствительности анализа и большому количеству ложноотрицательных результатов. В связи с этим целью настоящей работы была разработка и апробация полуавтоматического метода выделения провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека из цельной крови.

Материалы и методы.

В работе исследовали цельную кровь, полученную от 205 ВИЧ-инфицированных пациентов. Кровь забирали из локтевой вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА. Цельную кровь хранили при температуре 2-80С не более 3 дней.

Анализ крови на наличие ДНК ВИЧ осуществляли с помощью ПЦР тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96». Методика ПЦР-анализа состояла из четырех этапов: получение лейкоцитов из цельной крови, лизис клеток с высвобождением ДНК, амплификация ДНК, детекция продуктов амплификации.

Получение лейкоцитов из цельной крови.

Лейкоциты крови получали двумя способами:

1. с помощью методики, используемой в тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96»”;

2. с помощью разработанной нами полуавтоматической методики.

Методика выделение лейкоцитов из цельной крови, используемая в тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96»”.

Методика заключается в селективном лизисе эритроцитов крови с помощью раствора «Гемолитик». Для анализа использовали 250 мкл цельной крови. В результате 3-кратной обработки крови раствором «Гемолитик» получали осадок лейкоцитов.

Полуавтоматическая методика выделения лейкоцитов из цельной крови.

В основу разработанной нами методики был положен принцип иммуной сорбции клеток крови, содержащих CD4 рецепторы (т.е.  тех клеток, которые инфицирует и в геном которых интегрирует вирус иммунодефицита человека). В качестве «сорбента» использовали парамагнитные частицы, покрытые моноклональными антителами, специфичные к CD4-рецепторам («Dynal», Норвегия). Выделение CD4-клеток, связавшихся с магнитными частицами, проводили с помощью полуавтоматического экстрактора «KingFisher» («Thermo Labsystems», Финляндия).

Для выделения клеток использовали 1мл цельной крови, в которую добавляли 30 мкл магнитных частиц. После инкубации и отмывки иммунокомплекса, состоящего из магнитных частиц и СD4 лимфоцитов, получали чистую фракцию CD4-лимфоцитов.

Лизис клеток.

Клетки крови, полученные двумя способами, лизировали с помощью раствора «Цитолизин» при температуре 600С 30 минут.

Амплификация. Выделенную с помощью выше описанных методик ДНК переносили в реакционную смесь для проведения реакции амплификации. Реакционная смесь для ПЦР содержала биотинилированные праймеры, комплементарные области pol ВИЧ1. Амплификацию проводили по программе: 950С — 5 минут, 5 циклов: 950С — 15 секунд, 550С — 15 секунд, 720С — 15 секунд, 30 циклов: 950С — 15 секунд, 580С — 15 секунд, 720С — 15 секунд.

Детекция продуктов амплификации. Детекцию осуществляли методом гибридизационно-ферментного анализа (ГИФА) на иммунологических планшетах, покрытых ДНК зондом, комплементарным внутренней части ампликона.

Анализ результатов.

Пробу считали положительной, если оптическая плотность в лунках микропланшета превышала 0,35 ОЕ. Пробу считали отрицательной, если оптическая плотность в лунках микропланшета была меньше 0,35 ОЕ.

Для сравнения двух методик выделения ДНК на этапе ГИФА анализировали не только исходные образцы ампликонов, но и их разведения (для получения результатов оптической плотности в пределах линейного диапазона спектрофотометра от 0,35 до 2,0 ОЕ). Для этого перед началом проведения ГИФА из исходного ампликона делали серию последовательных 5-кратных разведений.

Результаты.

Сравнение разных методик выделения ДНК показало, что в обоих случаях были получены положительные результаты, как в исходных продуктах амплификации, так и в их разведениях, причем количество разведений с положительным результатом было одинаковым (табл. 1.). Как видно из таблицы 1 значения оптических плотностей в максимальных разведениях (1:625) не отличались друг от друга.

Таблица 1. Результаты ГИФА детекции продуктов амплификации, взятых в разведениях.

Образец А

Значения оптической плотности

Разведения

ампликонов

1

2

4.909

5.776

исходное

4.567

4.749

1:5

3.530

3.930

1:25

1.104

1.230

1:125

0.401

0.419

1:625

0.223

0.190

1:3125

0.105

0.110

1:15625

0.102

0.104

1:78125

1 – результаты, полученные при использовании методики выделения ДНК с использованием раствора «Гемолитик».

2 – результаты, полученные при использовании полуавтоматической методики выделения ДНК.

В процессе апробации разработанной методики на клиническом материале в сравнении с методикой, используемой в тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» было параллельно протестировано 205 образцов цельной крови от ВИЧ-инфицированных пациентов. Получили полное совпадение результатов: во всех исследуемых  образцах была выявлена ДНК ВИЧ независимо от использованной методики выделения.

Заключение.

Эффективность выделения ДНК с помощью разработанной полуавтоматической методики была идентична эффективности методики, используемой в тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96». Использование прибора «KingFisher» позволяет автоматизировать и значительно ускорить процедуру выделения ДНК, а также уменьшить количество лабораторных ошибок на этапе пробоподготовки.