Федеральный Центр СПИД

0

Разработка модифицированной версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М».

Богословская Е.В., Башкирова Л.Ю., Шипулин Г.А.

Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва.

Введение. На сегодняшний день из 42 миллионов человек, живущих с ВИЧ-инфекцией, 3,2 миллиона составляют дети. По оценкам Программы ООН по ВИЧ/СПИД (UNAIDS) в 2003 году 700 000 детей были инфицированы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), из них 90% — дети, рожденные инфицированными матерями, и получившими вирус внутриутробно, в родах или при грудном вскармливании. В России по состоянию на 10 февраля 2004 года зарегистрировано 266820 случаев ВИЧ-инфекции, из них 9154 среди детей. В 2002 году от ВИЧ-инфицированных матерей родилось 2770 детей — это 60% от всех рожденных в России детей с риском перинатальной передачи ВИЧ.

Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, затруднена в связи с тем, что в крови таких детей в течение длительного времени сохраняются материнские антитела к ВИЧ. Но далеко не каждый ребенок, рожденный инфицированной женщиной, заражен ВИЧ. Риск вертикальной передачи ВИЧ-инфекции колеблется от 10 до 40%. Проведение профилактических мероприятий (противовирусная терапия, родоразрешение путем кесарева сечения, отказ от кормления грудью и другие мероприятия) позволяют снизить риск передачи ВИЧ до 2–5%. По существующим в России рекомендациям постановка или снятие диагноза ВИЧ-инфекции детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, проводится на основании результатов серологического обследования не ранее 18 месяцев [1].

Проблема более ранней диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей за рубежом была решена несколько лет назад с появлением молекулярно-генетические методов, которые позволяют выявлять фрагменты генома ВИЧ в периферической крови на ранних сроках инфицирования. Было показано, что у большинства инфицированных детей ДНК ВИЧ определяется к 1 месяцу жизни и практически у всех к 6 месяцу. В России до сих пор молекулярные методы диагностики ВИЧ у новорожденных детей не нашли широко применения. В основном это связано с высокой стоимостью зарубежных тест-систем и отсутствием до последнего времени аналогичного теста отечественного производства.

В 1997 году в Центральном НИИ Эпидемиологии МЗ РФ была разработана тест-система (на основе полимеразной цепной реакции) для выявления ДНК ВИЧ «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96». Тест-система прошла Государственные испытания в ГИСК им. А.Л.  Тарасевича, и в 2002 году было получено разрешение Министерства Здравоохранения на применение тест-системы на территории РФ (регистрационное удостоверение № PN001634/01–2002; лицензия на производство № 15/0002-Л/02). Единственной зарубежной тест-системой, доступной в России, является «Amplicor HIV 1 test» фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария). Методики, положенные в основу отечественной и зарубежной тест-систем, аналогичны. В обеих тест-системах используются одинаковые праймеры, комплиментарные области генома ВИЧ — gag — гену, предложенные в 1988 году Shirley Kwok. Клинические испытания отечественной тест-системы были проведены на 175 образцах от 107 пациентов в сравнении с тест-системой «Amplicor HIV 1 test». Были определены основные характеристики тест-системы: чувствительность 96%, специфичность 100% [3].

В последние годы стали появляться данные о том, что тест-система «Amplicor HIV 1 test» обладает более низкой чувствительностью по сравнению с заявленной. Было показано, что используемые в тест-системе праймеры позволяют детектировать 87% изолятов подвида А, 67% изолятов подвида В, 66% изолятов подвида Е, 88% изолятов подвида F [2]. Поэтому чувствительность тест-системы зависит от распространенности разных подвидов ВИЧ на данной территории. На территории России распространено большинство из известных подвидов ВИЧ. Кроме того, если до 1996 года в России доминировал субтип В, то в 2002 году субтип А составил 93% от всех субтипов (по данным Бобкова А.Ф.).

Другим важным недостатком тест-систем как «Amplicor HIV 1 test», так и «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» является нестандартизованный метод выделения ДНК из клеток крови и отсутствие внутреннего контроля, что создает зависимость от качества выполнения процедур в процессе выделения ДНК и увеличивает частоту артефактных ложноотрицательных результатов. В 2003 году сотрудниками ФНМЦ СПИД была проведена оценка клинической чувствительности и специфичности тест-системы «Amplicor HIV 1 test» по результатам работы региональных центров СПИД [4]. Показатель специфичности составил 99%, показатель чувствительности 51%. Низкая выявляемость ВИЧ могла быть обусловлена двумя причинами: недостаточной чувствительностью праймеров в отношении доминирующего в России субтипа А, а также плохим уровнем подготовки персонала, что в совокупности с отсутствием внутреннего контроля в тест-системе приводило к получению ложноотрицательных результатов. В связи с этим целью настоящей работы была разработка и апробация второй версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М»”.

Материалы и методы. В работе были исследованы образцы цельной крови, полученные от следующих пациентов.

Первая группа была представлена 465 образцами цельной крови от 230 детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей и наблюдающихся стационарно или амбулаторно в КИБ №2 г. Москвы за период 1998-2001г.г. Возраст детей колебался от 1 дня до 1,5 лет.

Вторая группа состояла из 205 образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов, полученных из 12 регионов Российской Федерации в 2003 году. Все образцы были типированы методом секвенирования четырех фрагментов генома ВИЧ: гена протеазы, фрагмента гена обратной транскриптазы, фрагмента гена gag и фрагмента гена поверхностного белка. Из 205 образцов 93% составил субтип А, 5% — субтип В, 1,5%  — субтип G, 0,5%  — субтип С.

Подготовка проб крови. Кровь забирали из локтевой вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА. Цельную кровь хранили при температуре +2-80С не более 3 дней.

Выделение ДНК из клеток крови. Выделение ДНК проводили с помощью двух методик. Первый вариант представляет собой грубый лизис эритроцитов крови с помощью раствора «Гемолитик» (производства ЦНИИЭ МЗ РФ), в результате чего получали осадок лейкоцитов. Второй вариант представляет собой селективную иммуно-сорбцию CD4-лимфоцитов с помощью магнитных частиц, покрытых антителами к CD4 рецепторам, и полуавтоматического экстрактора KingFisher («Thermo Labsystems», Финляндия). В результате получали осадок CD4-лимфоцитов. Затем осадки лейкоцитов или CD4-лимфоцитов лизировали с помощью раствора «Цитолизин» (производства ЦНИИЭ МЗ РФ) при температуре 60°С в течение 30 минут.

Амплификация. Для эффективного выявления большинства субтипов ВИЧ-1 нами были выбраны праймеры в наиболее консервативной области генома ВИЧ — гене полимеразы. При подборе праймеров использовали базы данных нуклеотидных последовательностей и программы BLAST и OLIGO 3.30.  Праймеры синтезировали с помощью автоматического синтезатора ASM102. На 5`-конце один из праймеров мечен биотином, который необходим для гибридизационно-ферментной детекции продуктов амплификации.

Для оценки эффективности выделения ДНК, а также возможного ингибирования ПЦР были разработаны праймеры для амплификации участка клеточной ДНК — гена b-глобина. Один из праймеров для амплификации гена b-глобина на 5`-конце был помечен биотином.

Реакционная смесь для ПЦР содержала две пары праймеров: для выявления ВИЧ и гена b-глобина. Амплификацию проводили по программе: 950С — 5 минут, 5 циклов: 950С — 15 секунд, 550С — 15 секунд, 720С — 15 секунд, 30 циклов: 950С — 15 секунд, 580С — 15 секунд, 720С — 15 секунд.

Гибридизационно-ферментная детекция продуктов ПЦР. Детекцию осуществляли методом гибридизационно-ферментного анализа на иммунологических планшетах, покрытых одноцепочечным ДНК зондом, комплиментарным внутренней части ампликона. Для детекции продуктов ПЦР использовали два микропланшета: один — покрытый зондом к ВИЧ, второй — покрытый зондом к гену глобина.

Пробу считали положительной, если оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к ВИЧ, превышала 0,35 ОЕ. Пробу считали отрицательной, если оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к ВИЧ, была меньше 0,35 ОЕ, а оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к гену глобина, превышала 0,35 ОЕ.

Выявление ДНК ВИЧ с помощью тест-системы «Amplicor HIV 1 test». 205 образцов цельной крови от детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, было протестировано параллельно с помощью двух тест-систем «Amplicor HIV 1 test» и «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М». Определение ДНК ВИЧ с помощью тест-системы «Amplicor HIV 1 test» осуществляли согласно прилагаемой инструкции.

Тестирование коммерческой панели субтипов. Для того, чтобы доказать, что выбранные нами праймеры в области гена полимеразы эффективно выявляют большинство субтипов ВИЧ-1, была протестирована панель образцов плазмы крови (содержащая 10 субтипов ВИЧ-1), предоставленная Национальным институтом биологических стандартов и контролей Великобритании (NIBSC) (кат. № 01/466). Образцы плазмы тестировали с помощью количественной тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» (ЦНИИЭ МЗ РФ), в которой используются те же самые праймеры, комплиментарные гену полимеразы. Для сравнения результатов были использованы коммерческие тест-системы «Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5»  фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария) и «LCx HIV RNA Quantitative assay» фирмы «Эбботт» (США). В тест-системе «Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5»  используются праймеры, отличные от тех, которые используются в качественной тест-системе «Amplicor HIV-1 test».

Результаты.

Коммерческая панель образцов NIBSC, содержащих вирусные препараты 10 субтипов ВИЧ-1, была проанализирована с помощью трех количественных тест-систем «Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5»  («Хоффманн-Ла Рош», Швейцария), «LCx HIV RNA Quantitative assay» («Эбботт», США) и «АмплиСенс ВИЧ Монитор» (ЦНИИЭ МЗ РФ). Результаты измерения концентрации РНК ВИЧ представлены в таблице 1.

Субтипы ВИЧ-1

Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5

LCx HIV RNA Quantitative assay

АмплиСенс ВИЧ Монитор

1

3,68×103

3,54х103

1,62х104

2

H

1,25×104

5,40х103

1,58х104

3

A

4,31×103

3,80х103

1,17х104

4

N

2,63×103

596

< 500

5

B

2,26×103

2,51х103

4,18х103

6

E

5,05×103

3,89х103

1,12х104

7

O

8

D

2,81×103

6,68х103

1,47х104

9

G

4,82×103

3,36х103

2,46х103

10

F

5,08×103

5,12х103

5,96х103

Как видно из таблицы большинство субтипов ВИЧ-1 тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор» выявляет с такой же эффективностью, что и зарубежные коммерческие тест-системы. Отечественная тест-система не выявляет ВИЧ группы О и плохо выявляет ВИЧ группы N.

Для сравнения двух вариантов выделения ДНК из цельной крови было протестировано 205 образцов цельной крови от ВИЧ-инфицированных пациентов с помощью тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М» в трех повторах: 2 повтора в варианте лизиса эритроцитов с помощью гемолитика и 1 повтор в варианте иммуно-сорбции. Всего было выполнено 615 ПЦР-анализов. Для 205 образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов был получен положительный результат на ВИЧ (во всех трех повторах, независимо от прохождения внутреннего контроля). В 24 случаях наблюдалось отсутствие оптического сигнала в лунках микропланшета, покрытых зондом к гену глобина. Причинами могли быть потеря осадка лейкоцитов в процессе выделения ДНК или наличие ингибиторов ПЦР в выделенной пробе. В 15 случаях кровь обрабатывали раствором гемолитика, в 9 — кровь обрабатывали в варианте иммуно-сорбции. При перестановке этих образцов ингибирующего эффекта не наблюдалось.

При исследовании 465 образцов цельной крови от 230 детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, было выявлено 26 детей, инфицированных ВИЧ (11,3%). При параллельном тестировании 205 образцов с помощью тест-системы «Amplicor HIV 1 test» было получено полное совпадение результатов.

Обсуждение.

Ранняя диагностика ВИЧ-инфекция у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, может быть осуществима только с помощью молекулярно-генетических методов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Использующиеся до настоящего времени в России тест-системы («АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» и «Amplicor HIV-1 test») обладают рядом существенных недостатков, которые ограничивают использование этих тестов в нашей стране. Главным недостатком тест-систем являются используемые праймеры, выбранные в 1988 году и предназначенные в основном для выявления ВИЧ субтипа В. В России в настоящее время доминирует субтип А, который выявляется с помощью данных праймеров с чувствительностью 87%. Другим важным недостатком является отсутствие внутреннего контроля, что может приводить к появлению большого количества ложноотрицательных результатов.

В результате нами была предпринята попытка разработать новую тест-систему для выявления ДНК ВИЧ, которая будет лишена всех выше перечисленных недостатков. Новая версия тест-системы, получившая название «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», имеет следующие отличительные особенности. В тест-системе используются праймеры, выбранные нами в области гена полимеразы (наиболее консервативная область генома ВИЧ), которые позволяют эффективно выявлять большинство субтипов ВИЧ-1. Для экспериментального подтверждения были использованы количественные тест-системы для определения концентрации РНК ВИЧ и коммерческая панель образцов плазмы крови, содержащая 10 субтипов ВИЧ-1 (NIBSC, кат. № 01/466). Причин для такого эксперимента было несколько. Во-первых, в мире не существует коммерческих панелей, содержащих провирусную ДНК ВИЧ разных субтипов. Во-вторых, количественные анализы позволяют с большей точностью говорить о том, на сколько эффективно выявляется тот или иной субтип. Для сравнения количественных результатов были использованы 2 коммерческие тест-системы «Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5»  фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария) и «LCx HIV RNA Quantitative assay» фирмы «Эбботт» (США), которые должны с одинаковой эффективностью выявлять большинство субтипов ВИЧ-1, включенных в изучаемую панель.

Все субтипы ВИЧ, относящиеся к группе М, с одинаковой эффективностью были выявлены с помощью трех используемых тест-систем. Ни одна из тест-систем не выявила образец, содержащий ВИЧ группы О. Отечественная тест-система с низкой эффективностью выявляла образец, содержащий ВИЧ группы N. Однако, актуальность выявления вируса из групп N и О не высока в силу низкой распространенности этих групп ВИЧ в популяции (в России не было до сих пор выявлено ни одного пациента, инфицированного ВИЧ групп N и О).

Второй важной особенностью новой версии тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» является использование внутреннего контроля. В качестве внутреннего контроля была использована человеческая геномная ДНК (выбранные праймеры комплиментарны области гена b-глобина), которая экстрагируется из лейкоцитов крови вместе с ДНК ВИЧ, встроенной в человеческую ДНК. В наших экспериментах наблюдалось ингибирование внутреннего контроля в 3% случаев. В лабораториях, где работают менее опытные врачи-лаборанты, частота ингибирования внутреннего контроля может быть значительно выше.

Третьей особенностью тест-системы является возможность использования полуавтоматического метода выделения CD4-лимфоцитов из цельной крови. Данный подход позволил упростить и стандартизовать методику выделения клеток крови, инфицированных ВИЧ.

Исследование образцов из группы ВИЧ-инфицированных пациентов показало, что с помощью тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 100% случаев была выявлена ДНК ВИЧ. Стопроцентная выявляемость ДНК ВИЧ, несмотря на ингибирование ВКО в 3% случаев, свидетельствует о высокой концентрации ДНК ВИЧ в этих образцах. Однако не исключена возможность появления таких образцов крови, в которых концентрация ВИЧ будет низкая. Тогда даже небольшое ингибирование ПЦР приведет к появлению ложноотрицательного результата. В нашем исследовании из 205 образцов крови была выявлена одна с низким содержанием ДНК ВИЧ (оптический сигнал для данного образца колебался в диапазоне 0,8–2,8 OD при отсутствии признаков ингибирования).

Для определения диагностической ценности тест-системы была протестирована группа детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Из 230 детей 26 оказались инфицированными ВИЧ. Из 205 образцов крови от новорожденных детей, исследованных параллельно с помощью тест-систем «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» и «Amplicor HIV-1 test», не было выявлено ни одного дискордантного результата. Одинаковая выявляемость ДНК ВИЧ может объясняться с одной стороны высокой концентрацией вируса в исследуемых образцах, с другой стороны тем, что в 1998–2001 годах в Москве у беременных женщин доминировал ВИЧ субтипа В, который с высокой эффективностью выявляется обеими тест-системами.

Заключение.

Модифицированная тест-система «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М» обладает рядом преимуществ по сравнению с аналогичными тест-системами первого поколения: используемые праймеры, комплиментарные наиболее консервативной области генома ВИЧ – гену полимеразы, позволяют выявлять большинство субтипов ВИЧ-1; стандартизованный метод выделения ДНК и наличие внутреннего контроля позволяет полностью исключить риск появления ложноотрицательных результатов, приближая эффективность ДНК-диагностики ВИЧ-инфекции к 100%.

Расширенные клинические испытания доказали возможность использования тест-системы как для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции у ВИЧ-инфицированных взрослых пациентов, так и для ранней постановки диагноза ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.

1. Инструкция по профилактике передачи ВИЧ-инфекции от матери ребенку и образца информированного согласия на проведение химиопрофилактики ВИЧ (Утверждено приказом МЗ РФ 19.12.2003, № 606).

2. Respess R.A., Butcher A., Wang H. et al. // J. Clin. Microbiol. — 1997. — Vol. 35. — p. 1284–1286.

3. Изучение чувствительности и специфичности отечественной ПЦР-тест-системы для диагностики ВИЧ-инфекции. // К.А.  Саркисян, Г.А.  Шипулин, М.С.  Воробьева, О.Ю.  Шипулина, В.И.  Шахгильдян, Л.В.  Серебровская, В.В.  Покровский. //

4. Применение тест-системы Amplicor HIV-1 для диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей в России: первые результаты (2001–2002 г.г.). // Бобкова М.Р., Буравцова Е.В., Суханова А.Л.  и др. // Клиническая Лабораторная Диагностика. — 2003. — № 6. — с. 49–53.